番茄潰瘍病檢測(cè)操作流程及關(guān)鍵步驟  

一、現(xiàn)場(chǎng)檢疫與抽樣  

癥狀觀察：檢查番茄植株、莖稈、葉片及果實(shí)是否出現(xiàn)典型癥狀，如葉片邊緣干枯、莖部潰瘍斑（維管束變褐、髓部腐爛）、果實(shí)表面“鳥(niǎo)眼斑”（白色暈圈中央黑褐色小點(diǎn)）等。  

抽樣規(guī)范：按《SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣》標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，每份種子樣品需種植5000粒以上（最少3000粒），果實(shí)或病株樣本需采集病健交界部位，經(jīng)70%酒精或7%次氯酸鈉表面消毒后備用。  

二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)步驟  

種植觀察  

將種子種植于滅菌土壤/基質(zhì)中，在24-34℃、濕度≥70%條件下培養(yǎng)，出苗后15天內(nèi)觀察幼苗是否出現(xiàn)萎蔫、壞死斑點(diǎn)等典型癥狀。  

分離培養(yǎng)  

使用半選擇性培養(yǎng)基（如SCM、mSCM）劃線培養(yǎng)，25-28℃培養(yǎng)7-10天，觀察菌落特征（如D2ANX培養(yǎng)基上黃色黏液狀菌落，YDC培養(yǎng)基上圓形凸起黃色菌落）。  

挑取可疑菌落進(jìn)行純化，通過(guò)紫茉莉接種或番茄幼苗穿刺接種驗(yàn)證致病性。  

分子生物學(xué)檢測(cè)  

提取DNA后，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)片段（如引物5'-TCAGGCGTCTGTTCTGGC-3'和5'-CCCACCACCATCCACAAC-3'，預(yù)期產(chǎn)物223bp），通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)合DNAMarker判定結(jié)果。  

致病性測(cè)定  

紫茉莉接種：菌懸液濃度1×10?CFU/mL，注射后18-36℃培養(yǎng)36-48小時(shí)，觀察過(guò)敏性壞死斑。  

番茄幼苗接種：在子葉與真葉間莖部穿刺接種，25-32℃光照培養(yǎng)，2-3周后觀察萎蔫、潰瘍斑等癥狀。  

三、結(jié)果判定與質(zhì)量控制  

判定標(biāo)準(zhǔn)：需同時(shí)滿足癥狀符合典型特征、分離菌落形態(tài)匹配、致病性測(cè)定陽(yáng)性、分子檢測(cè)擴(kuò)增目標(biāo)片段等條件，方可判定為番茄潰瘍病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）。  

對(duì)照設(shè)置：每批次檢測(cè)需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)菌株）、陰性對(duì)照（無(wú)菌水）及空白對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)可靠性。  

設(shè)備與安全：操作需在超凈工作臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)廢棄物經(jīng)高壓滅菌處理，接觸病原菌后洗手消毒。  

四、田間診斷要點(diǎn)補(bǔ)充  

多部位侵染特征：同時(shí)危害葉片（葉緣干枯）、莖稈（潰瘍斑、維管束變褐）、果實(shí)（鳥(niǎo)眼斑），區(qū)別于根腐病等單一部位病害。  

環(huán)境關(guān)聯(lián)性：高溫高濕（24-34℃、濕度≥70%）易發(fā)病，雨水/噴灌傳播，種子帶菌可遠(yuǎn)距離擴(kuò)散。